Design and development of multiepitope chimeric antigens by bioinformatic and bacterial based recombinant expression methods, with potential application for bovine tuberculosis serodiagnosis.

Bovine tuberculosis (bTB), which is caused by Mycobacterium bovis, is a single health concern, which causes economic losses, is a sanitary barrier and is a zoonotic concern. The golden-pattern intradermic tests have low sensitivity of about 50%. To fix this sensitivity problem, immunoassays could be a powerful tool. However, few studies produced antigens for bTB immunoassays, which needs improvements. Aim of this study was to produce multiepitope chimeric antigens (MCA) to use for bTB diagnosis. To achieve MCA design and development, extensive bibliographic search, antigenic epitope prediction, specificity, hydrophobicity, and 3D structure modeling analyses were performed, as well as cloning, expression and purification. Seven epitopes from four different target proteins (MPB-70, MPB-83, ESAT-6 and GroEL) were combined in five chimeras containing five repetitions of each epitope to enhance antibodies affinity. 3D predicted models revealed that all chimeras have a high percentage of disorder, which could enhance antibody recognition, although taking to protein instability. Each chimera was cloned into pET28a (+) expression plasmids and expressed in six Escherichia coli expression strains. Chimeras 3, 4 and 5 could be solubilized in 8 M urea and purified by ion exchange affinity chromatography. Against bTB positive and negative sera, purified chimera 5 had the best results in indirect dot blot and ELISA, as well as in lateral flow dot blot immunoassay. In conclusion, chimera 5, an MPB-83 containing MCA, could be used for further studies, aimed to develop a serologic or rapid test for bTB diagnosis.

Influence of lactation stages and rain periods on subclinical mastitis in meat producing ewes / Influência dos estágios de lactação e ocorrência de chuvas sobre a mastite subclínica em ovelhas com aptidão para produção de carne

ABSTRACT: Mastitis negatively influences the survival and weight gain of ovines for meat production. The purpose of this study was to investigate, in sheep for meat production, the occurrence of subclinical mastitis in ewes at the end of lactation and beginning of the consecutive lactation and to assess the composition and cellular characteristics of milk as a function of different rainfall indices. Mammary halves (821) of Santa Ines (479) and Morada Nova (342) ewes were examined. Milk samples were collected in two different moments of lactation: at weaning and postpartum of the consecutive lactation. Sample collection periods were called "dry" or "rainy" according to the rainfall index in the month immediately before the month of collection. The occurrence of subclinical mastitis at weaning in the Santa Ines and Morada Nova ewes were 16.4 and 12.6% in the dry period, and 17.7 and 23.5% in the rainy period, respectively. In the consecutive lactation period, the occurrences were 26.7 and 27.7% in the dry period and 41.8 and 39.1% in the rainy period, for the Santa Ines and Morada Nova ewes, respectively. Postpartum stage was critical for the occurrence of subclinical mastitis, as compared to that at the end of the previous lactation. Occurrence of the disease negatively influenced the SCC in the milk at the beginning of lactation and changed its composition, mainly in the rainiest periods, probably due to a difficulty in maintaining hygiene in the environment where the animals remained.

RESUMO: A mastite influencia negativamente na sobrevivência e no ganho de peso em ovinos com aptidão para produção de carne. O objetivo do presente estudo foi investigar, em ovelhas para produção de carne, a ocorrência de mastite ovina subclínica, no final de lactação e no início da lactação consecutiva, bem como avaliar as características composicionais e celulares do leite em função de diferentes índices pluviométricos. Metades mamárias (821) das raças 'Santa Inês' (479) e 'Morada Nova' (342) foram analisadas. As amostras de leite foram colhidas em dois estágios diferentes de lactação: no desmame e após o parto da lactação consecutiva. Os períodos de colheita de amostras foram denominados "seco" ou "chuvoso", conforme o índice de chuva no mês imediatamente antes ao mês da colheita. A ocorrência de mastite subclínica na desmama nas raças 'Santa Inês' e 'Morada Nova' foi de 16,4 e 12,6% no período seco, e 17,7 e 23,5% no período chuvoso, respectivamente. Na lactação consecutiva, as ocorrências foram 26,7 e 27,7% no período seco e 41,8 e 39,1% no período chuvoso, nas ovelhas 'Santa Inês' e 'Morada Nova', respectivamente. O período pós-parto foi crítico para a ocorrência de mastite subclínica, comparado àquele no final da lactação anterior. A ocorrência da doença teve uma influência negativa na CCS do leite no início da lactação e alterou sua composição, principalmente nos períodos mais chuvosos, provavelmente por dificuldade em manter a higiene no ambiente onde os animais permaneceram.

Frequência de ovinos soropositivos para lentivírus de pequenos ruminantes no município de Colinas do Tocantins, estado do Tocantins, Brasil / Frequency of antibodies against ovine Lentivirus in sheep in Colinas do Tocantins, Tocantins state, Brazil

Maedi-Visna (MV) é uma enfermidade causada por lentivírus de pequenos ruminantes com evolução crônica e em grande parte dos casos sinais clínicos inaparentes. O diagnóstico da doença é baseado em sinais clínicos e dados epidemiológicos, sendo a imunodifusão em gel de ágar (IDGA) o método padrão para a detecção sorológica de anticorpos contra o lentivírus. Sabendo que o estado do Tocantins possui potencial para o desenvolvimento da ovinocultura e que grande parte dos produtores de Colinas do Tocantins, no referido estado, possui interesse em estabelecer criação racional, esta pesquisa teve por objetivo a realização de um estudo acerca da soroprevalência da doença. Foram coletadas 369 amostras de sangue de ovinos, independentemente de raça, sexo e idade, de diferentes propriedades rurais do município para diagnóstico de MV utilizando a técnica de IDGA. Após as análises laboratoriais, para avaliação dos resultados no tocante às categorias, foi utilizado o teste exato de Fisher e também foi calculado o odds ratio , com intervalo de confiança de 95% para verificação da idade como possível fator de risco ou de proteção. Constatou-se que 6 animais (1,62%) se apresentaram positivos no IDGA. Diante desses resultados, foi possível concluir que a frequência de ovinos soropositivos no município é baixa.(AU)

Maedi-Visna is a disease caused by a small ruminant lentivirus, with a chronic evolution and, in most cases, unapparent signs. Its diagnosis is based on clinical signs and epidemiological data, with the agar gel immunodiffusion (AGID) test being the classical method for detecting antibodies against lentiviruses. Considering that the state of Tocantins has the potential to develop sheep breeding and that the majority of producers from Colinas do Tocantins city has shown an interest in establishing a rational breeding, this study aimed to determine the prevalence of such disease in that region. A total of 369 blood samples was drawn from sheep bred in several farms of that town, regardless of breed, gender, and age. Every sample underwent an AGID to test for Maedi-Visna. After the laboratory analyses were concluded, the Fisher's exact test was used to evaluate the results against the categories. Also, the odds ratio, with 95% confidence interval, was calculated to check whether age played a role as either a risk or protective factor in these results. It was found that six animals (1.62%) were positive in AGID, therefore concluding that the frequency of seropositivity in that region is low.(AU)

Distribution of PLD and FagA, B, C and D genes in Corynebacterium pseudotuberculosis isolates from sheep and goats with caseus lymphadenitis.

Caseous lymphadenits (CL) is a chronic and subclinical disease that affects goats and sheep and, consequently, causes economic losses, especially to small producers. The purpose of this study, through use of Polymerase Chain Reaction (PCR), was to verify the presence of virulence genes of phospholipase D (PLD), integral membrane protein (FagA), iron enterobactin transporter (FagB), ATP binding cytoplasmic membrane protein (FagC) and iron siderophore binding protein (FagD) in 168 isolates of C. pseudotuberculosis obtained from cases of caseous lymphadenitis in goats and sheep. FagA, FagB and PLD genes were detected in all 145 strains isolated from abscesses in superficial lymph nodes and in 23 strains isolated from viscera. The FagC gene was positive in 167 (99.40%) isolates. The FagD gene was detected in 160 (95.23%) isolates. All virulence factors analyzed were found more frequently among isolates collected in the viscera of animals with CL, indicating a multifactorial nature, as well as variations, in the invasive potential of C. pseudotuberculosis strains.

Antimicrobial resistance of Staphylococcus spp. from small ruminant mastitis in Brazil / Resistência antimicrobiana de Staphylococcus spp. de mastite de pequenos ruminantes no Brasil

The study aimed to determine the antimicrobial resistance patterns and to identify molecular resistance markers in Staphylococcus spp. (n=210) isolated from small ruminant mastitis in Brazil. The antimicrobial resistance patterns were evaluated by the disk diffusion test and by detection of the presence of mecA, blaZ, ermA, ermB, ermC and msrA genes by PCR. The efflux pump test was performed using ethidium bromide and biofilm production was determined by Congo red agar test along with PCR for detection of the icaD gene. The isolates were most resistant to amoxicillin (50.0%), streptomycin (42.8%), tetracycline (40.4%), lincomycin (39.0%) and erythromycin (33.8%). Pan-susceptibility to all tested drugs was observed in 71 (33.8%) isolates and 41 Staphylococcus isolates were positive for the efflux pump. Although phenotypic resistance to oxacillin was observed in 12.8% of the isolates, none harbored the mecA gene. However, 45.7% of the isolates harbored blaZ indicating that beta-lactamase production was the main mechanism associated with staphylococci resistance to beta-lactams in the present study. The other determinants of resistance to antimicrobial agents ermA, ermB, ermC, and msrA were observed in 1.4%, 10.4%, 16.2%, and 0.9% of the isolates, respectively. In addition, the icaD gen was detected in 32.9% of the isolates. Seventy three isolates (54 from goats and 19 from sheep) were negative for all resistance genes tested and 69 isolates presented two or more resistance genes. Association among blaZ, ermA, ermB, ermC and efflux pump were observed in 17 isolates, 14 of which originated from goats and three from sheep. The data obtained in this study show the resistance of the isolates to beta-lactamics, which may be associated with the use of antimicrobial drugs without veterinary control.

O presente trabalho teve como objetivo determinar os padrões de resistência a agentes antimicrobianos e identificar marcadores moleculares de resistência em Staphylococcus spp. (n=210) isolados de mastite de pequenos ruminantes no Brasil. Os padrões de resistência a agentes antimicrobianos foram avaliados pelo teste de difusão em disco e pela detecção da presença dos genes mecA, blaZ, ermA, ermB, ermC e msrA via PCR. O teste da bomba de efluxo foi realizado utilizando brometo de etídio e a produção de biofime foi determinada pelo teste do vermelho congo em paralelo com o PCR para detecção do gene icaD. Os isolados foram mais resistentes a amoxicilina (50,0%), estreptomicina (42,8%), tetraciclina (40,4%), lincomicina (39,0%) e eritromicina (33,8%). Setenta e um (33,8%) isolados foram sensíveis a todas as drogas testadas e 41 foram positivos para a bomba de efluxo. Embora a resistência fenotípica a oxacilina tenha sido observada observada em 12,8% dos isolados, nenhum possuiu o gene mecA. Entretanto, 45,7% dos isolados continham a gene blaZ, indicando que a produção de beta-lactamases foi o principal mecanismo associado com a resistência dos Staphylococcus aos beta-lactâmicos. Os outros determinantes de resistência a agentes antimicrobianos ermA, ermb, ermC e msrA foram observados em 1,4%, 10,4%, 16,2% e 0,9% dos isolados respectivamente. Além disso, o gene icaD foi detectado em 32,9% dos isolados. Setenta e três isolados (54 de cabras e 19 de ovelhas) foram negativos para todos os genes de resistência testados e 69 isolados apresentaram dois ou mais genes de resistência. A associação entre blaZ, ermA, ermB, ermC e bomba de efluxo foi observada em 17 isolados dos quais 14 eram oriundos de cabras e três de ovelhas. Os dados obtidos no presente estudo indicam a resistência dos isolados aos beta-lactâmicos, o que pode estar associado ao uso sem controle veterinário destas drogas nos animais.

Etiologia e perfil de sensibilidade antimicrobiana dos isolados bacterianos da mastite em pequenos ruminantes e concordância de técnicas empregadas no diagnóstico / Etiology and profile of antimicrobial sensitivity of bacteria from small ruminant mastitis and relationship of diagnostic techniques

A mastite é a inflamação da glândula mamária que acomete raças de aptidão leiteira como também aquelas voltadas para produção de carne. Esta enfermidade ocasiona sérias alterações na produção de leite e na sua qualidade, redução no ganho de peso e mortalidade de cordeiros. O presente estudo teve por objetivo conhecer os principais agentes causadores de mastite em ovinos e caprinos, bem como a sua susceptibilidade aos agentes antimicrobianos, além de avaliar o grau de concordância entre testes diagnósticos. Foram visitadas 25 propriedades durante a realização do experimento, sendo criatórios de caprinos, ovinos e rebanhos mistos, nos estados de Pernambuco e Bahia. Coletou-se leite de 439 caprinos e 76 ovinos. Foi realizada lactocultura, o California Mastitis Test (CMT) e o teste de sensibilidade aos antimicrobianos. Além disso, determinou-se o grau de concordância entre os testes diagnósticos empregados. Foi constatada uma maior freqüência de Staphylococcus spp. nos casos de mastite em caprinos e ovinos, sendo observado ainda, isolados de Streptococcus spp., Corynebacterium spp. e bacilos gram negativos (BGN). Os isolados apresentaram alta sensibilidade aos antimicrobianos testados, sendo o menor percentual de sensibilidade observado para o ácido nalidíxico. Em relação ao diagnóstico da mastite caprina, a análise comparativa entre o exame microbiológico e o CMT demonstrou um grau de concordância igual a K=0,17, enquanto que para a espécie ovina, este valor foi de K=0,22. A utilização do CMT para o diagnóstico da mastite subclínica em cabras e ovelhas deverá ser associado à técnica da lactocultura.

Mastitis is an inflammation of mammary gland, that are important in milking breed as well in meat ones. It is associated with serious reduction in milk production and quality, lambs weight gain reduction and mortality The goal of this work was determine the major etiologic agents of goat and sheep mastitis, as well as antimicrobial drug-resistance patterns and the agreement between two different diagnostic tools. We visit 25 goat, sheep, and goat and sheep farms in Pernambuco and Bahia State, and a total of 439 goats and 76 sheep milk samples were collected. To diagnose of small ruminant mastitis were compared two tests: Milk culture and California Mastitis Test (CMT). The bacterial drug-resistance pattern was determined by Kirby Bauer test. Staphylococcus spp. was the most frequent bacteria isolated from goat and sheep mastitis cases. Streptococcus spp., Corynebacterium spp. and gram-negative bacilli were isolated. It was possible to observe the high sensitivity to antimicrobial drugs in all tested bacteria, being the lower sensitivity percentage determined to nalidixic acid. Considering caprine mastitis diagnostic the comparative analysis between microbiologic culture and shown a concordance degree of K=0,17, although to ovine species these value was K=0,22. The use of CMT to subclinical mastitis diagnostic in goat and ewes must be associated to milk bacterial culture.

Etiologia e perfil de sensibilidade antimicrobiana dos isolados bacterianos da mastite em pequenos ruminantes e concordância de técnicas empregadas no diagnóstico / / Etiology and profile of antimicrobial sensitivity of bacteria from small ruminant mastitis and relationship of diagnostic techniques

A mastite é a inflamação da glândula mamária que acomete raças de aptidão leiteira como também aquelas voltadas para produção de carne. Esta enfermidade ocasiona sérias alterações na produção de leite e na sua qualidade, redução no ganho de peso e mortalidade de cordeiros. O presente estudo teve por objetivo conhecer os principais agentes causadores de mastite em ovinos e caprinos, bem como a sua susceptibilidade aos agentes antimicrobianos, além de avaliar o grau de concordância entre testes diagnósticos. Foram visitadas 25 propriedades durante a realização do experimento, sendo criatórios de caprinos, ovinos e rebanhos mistos, nos estados de Pernambuco e Bahia. Coletou-se leite de 439 caprinos e 76 ovinos. Foi realizada lactocultura, o California Mastitis Test (CMT) e o teste de sensibilidade aos antimicrobianos. Além disso, determinou-se o grau de concordância entre os testes diagnósticos empregados. Foi constatada uma maior freqüência de Staphylococcus spp. nos casos de mastite em caprinos e ovinos, sendo observado ainda, isolados de Streptococcus spp., Corynebacterium spp. e bacilos gram negativos (BGN). Os isolados apresentaram alta sensibilidade aos antimicrobianos testados, sendo o menor percentual de sensibilidade observado para o ácido nalidíxico. Em relação ao diagnóstico da mastite caprina, a análise comparativa entre o exame microbiológico e o CMT demonstrou um grau de concordância igual a K=0,17, enquanto que para a espécie ovina, este valor foi de K=0,22. A utilização do CMT para o diagnóstico da mastite subclínica em cabras e ovelhas deverá ser associado à técnica da lactocultura.

Mastitis is an inflammation of mammary gland, that are important in milking breed as well in meat ones. It is associated with serious reduction in milk production and quality, lambs weight gain reduction and mortality The goal of this work was determine the major etiologic agents of goat and sheep mastitis, as well as antimicrobial drug-resistance patterns and the agreement between two different diagnostic tools. We visit 25 goat, sheep, and goat and sheep farms in Pernambuco and Bahia State, and a total of 439 goats and 76 sheep milk samples were collected. To diagnose of small ruminant mastitis were compared two tests: Milk culture and California Mastitis Test (CMT). The bacterial drug-resistance pattern was determined by Kirby Bauer test. Staphylococcus spp. was the most frequent bacteria isolated from goat and sheep mastitis cases. Streptococcus spp., Corynebacterium spp. and gram-negative bacilli were isolated. It was possible to observe the high sensitivity to antimicrobial drugs in all tested bacteria, being the lower sensitivity percentage determined to nalidixic acid. Considering caprine mastitis diagnostic the comparative analysis between microbiologic culture and shown a concordance degree of K=0,17, although to ovine species these value was K=0,22. The use of CMT to subclinical mastitis diagnostic in goat and ewes must be associated to milk bacterial culture.

Staphylococcus aureus portadores de genes de toxinas isolados em amostras de diferentes fontes de transmissão durante a ordenha / Toxin gene-carrier Staphylococcus aureus isolated from diverse transmission sources during the milking

No presente estudo foi analisada a bactéria S. aureus isolada de diferentes fontes de transmissão durante a ordenha de vacas por meio de técnica de amplificação de genes da toxina. As amostras de leite e do sóstios foram obtidas antes da ordenha dos animais e as de teteiras antes e durante a ordenha sob diferentes condições climáticas. A análise dos genes das enterotoxinas A a D e da toxina da síndrome do choque tóxico foi efetuada por meio de técnica de amplificação das respectivas sequências codificadoras. O genes e a foi o mais prevalente dentre os pesquisados e a maioria dos isolados foi detectada em amostras de leite de quartos mamários com mastite. A presença de genes de toxinas estafilocócicas em S. aureus isolados de diferentes fontes de transmissão dentro da cadeia epidemiológica da mastite bovina evidencia a possibilidade de veiculação desse micro-organismo por meio de leite contaminado e que pode representar riscos à saúde pública.

Naturally acquired antibodies against Clostridium perfringens epsilon toxin in goats.

Clostridium perfringens type D-producing epsilon toxin is a common cause of death in sheep and goats worldwide. Although anti-epsilon toxin serum antibodies have been detected in healthy non-vaccinated sheep, the information regarding naturally acquired antibodies in ruminants is scanty. The objective of the present report was to characterize the development of naturally acquired antibodies against C. perfringens epsilon toxin in goats. The levels of anti-epsilon toxin antibodies in blood serum of goat kids from two different herds were examined continuously for 14 months. Goats were not vaccinated against any clostridial disease and received heterologous colostrums from cows that were not vaccinated against any clostridial disease. During the survey one of these flocks suffered an unexpectedly severe C. perfringens type D enterotoxemia outbreak. The results showed that natural acquired antibodies against C. perfringens epsilon toxin can appear as early as 6 weeks in young goats and increase with the age without evidence of clinical disease. The enterotoxemia outbreak was coincident with a significant increase in the level of anti-epsilon toxin antibodies.

Immunoprophylactic strategies against enterotoxemia caused by Clostridium perfringens type D in goats

Foi avaliada a resposta sorológica de vacina experimental contra a enterotoxemia em quatro grupos de caprinos. O Grupo 1 recebeu colostro de vacas não vacinadas e nenhuma dose de vacina. Os Grupos 2, 3 e 4 receberam colostro de vacas vacinadas, e uma dose de vacina aos 80 dias de idade nos Grupos 3 e 4. O Grupo 4 recebeu a segunda dose de vacina aos 120 dias de idade. Os níveis de anticorpos séricos foram avaliados pelo ELISA nas vacas antes e depois do parto e nos caprinos aos 3, 80, 120 e 160 dias de idade. Não houve diferença significativa nos níveis de anticorpos séricos das vacas vacinadas e não vacinadas, assim como entre os quatro grupos de caprinos avaliados aos três dias de vida. Os Grupos 3 e 4 apresentaram títulos médios de anticorpos de 0,6 UI/mL e 1,1 UI/mL, respectivamente, aos 40 dias após a primovacinação. A resposta vacinal do grupo 4, 40 dias após o reforço, foi de 1,8 UI/mL, superior ao Grupo 3 que foi de 0,2 UI/mL. Portanto, no esquema proposto, o uso de colostro não induziu a imunização passiva dos cabritos. No entanto, a primovacinação e reforço 40 dias após desencadearam níveis de anticorpos considerados satisfatórios.